近日，刘如谦团队再次在《自然》杂志发表重磅研究。此次他们采用“AI+连续进化”组合策略：首先借助人工智能模型ProteinMPNN对天然蛋白酶进行序列重设计，使其稳定性与表达水平显著提升；随后以该AI优化版本为起点，利用实验室连续进化（PACE）技术迫使蛋白酶切割原本无法识别的靶点。实验结果表明，该方法成功获得了针对非天然靶点、同时兼具高稳定性、高催化效率与高特异性的新型蛋白酶。

论文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-026-10820-0

具体而言，研究团队首先利用AI模型ProteinMPNN对天然蛋白酶进行序列重设计——保留底物识别与催化所必需的关键残基，其余位置由AI自主生成，并通过AlphaFold2评估结构稳定性。筛选出一批更稳定的变体后，将这些AI设计变体与天然酶一同置于PACE系统中进行并行进化，以观察哪类起点能更快学会切割新底物。结果令人惊喜：基于AI设计的BoNT/E不仅保留了新底物特异性，还在表达量、稳定性和可进化性方面大幅提升；同时修复了PTEN靶向变体原有的稳定性缺陷；甚至成功进化出高特异性的ataxin-2靶向蛋白酶。

这种“先以AI设计稳固骨架，再通过定向进化优化功能”的思路，为整个蛋白质工程领域提供了全新范式。未来，该方法有望成为开发新型酶、治疗蛋白及其他功能蛋白的通用框架。

AI开辟了全新的进化起点

传统定向进化通常直接以天然酶为起点。然而，天然酶稳定性有限，难以承受大规模突变筛选；而经过人工改造或实验室进化获得的蛋白，又常面临稳定性、活性或特异性不足的困境。

刘如谦团队另辟蹊径：不急于从天然酶开始，而是先让AI计算生成一个更稳定、表达更高的版本，再以此计算设计版本作为自动化连续进化的起点。整体流程主要分为两步：

1. 计算设计：获得稳定化BoNT蛋白酶

以BoNT/E为模型，利用ProteinMPNN重新设计序列，保留底物识别与催化关键残基，其余位置由AI重新生成，并通过AlphaFold2评估结构合理性。对AI设计变体进行表达、纯化与活性测试后发现，多数变体均能切割天然底物SNAP25，其中D1、D2、D3三个变体表现尤为突出，最高催化效率达到野生型酶的2.8倍。

为排除模型依赖，团队还使用PROSS重新设计了BoNT/E，同样获得了表达、稳定性和酶动力学特性改善的变体。将该流程拓展至BoNT/F和BoNT/X，结果类似——催化效率得到保留或提升。

2. PACE进化：获得新底物切割能力

获得稳定化变体后，研究团队比较了AI设计变体D3与天然酶作为进化起点的优劣。让两类起点分别适应三个难度递增的新底物（415、413、412），通过PACE持续筛选更高效的变体。结果明确：AI设计变体在每个新底物上都获得了更高活性，尤其是在最难底物412上，成功率全面领先。突变互换实验揭示了一个关键现象：部分有益突变仅在AI设计背景下有效，移植到天然酶中则失效。

随后，团队尝试让BoNT/E切割与神经退行性疾病相关的蛋白——ataxin-2。分别从天然酶和AI设计蛋白酶出发，利用PACE筛选ataxin-2切割变体，并通过酶学与细胞实验验证其活性与选择性。

图｜计算蛋白质序列设计与连续进化整合流程概览，以及稳定化BoNT/E蛋白酶的重新设计。

比“天然酶”更胜一筹

整体来看，AI设计版蛋白酶在保留新底物特异性的同时，表达水平、稳定性和可进化性均得到显著提升。具体成果如下：

1. 改善已有进化蛋白酶

AI重新设计可直接提升已有进化酶的表达与稳定性。此前，PTEN切割变体E(4130)A2存在表达低、稳定性差的难解问题。研究团队将进化突变移植到AI设计变体D1、D2和D3中，结果新蛋白酶既保留了PTEN切割能力，又不会重新切割天然底物SNAP25。表达水平大幅提升：在大肠杆菌中提高了2.2至5.2倍；在HEK293T细胞中，D2和D3变体表达量提升超过24倍，PTEN切割产物分别增加4.5倍和3.9倍。

图｜将PACE进化得到的BoNT/E突变与ProteinMPNN重新设计结合，可提高重新编程的PTEN切割型BoNT/E蛋白酶变体的表达水平和活性。

2. 提升新底物进化效果

AI设计起点在新底物进化中表现更为优异。比较D3与天然BoNT/E在三个新底物上的PACE结果，D3更容易进化出高活性变体，稳定化设计显著改善了后续进化效果。在最难的底物412上，天然酶四组实验仅有两组成功，而D3四组全部成功；D3变体的PACE回路激活达到16至20倍，天然酶变体仅约10倍。突变互换实验再次证实：部分有益突变仅在AI设计背景下有效。

3. 扩展蛋白酶进化空间

重新设计起点使蛋白酶能够获得完全不同于天然酶的突变组合。以底物413为例，D3在进化过程中富集了天然酶中罕见的突变模式，说明AI设计后的蛋白酶可以探索更丰富的功能序列空间。

图｜基因型分布，以及中等难度进化过程中起始点特异性突变组合的变化。

为验证其他设计蛋白酶是否也能作为有效起点，团队测试了ProteinMPNN设计变体D4和PROSS设计变体PROSS1。结果显示，D4和PROSS1均能在三个新底物上通过PACE筛选，并形成不同于天然酶和D3的进化基因型。其中D4的初始催化速度虽然比天然酶低约20倍，但进化后仍获得了与其他设计起点相当甚至更高的活性。总体来看，三种重新设计起点产生的进化变体，活性均优于天然酶起点。

图｜替代重新设计起点的进化，以及对进化基因型在所有起始背景中功能的综合评估。

4. 进化ataxin-2靶向蛋白酶

序列重新设计起点产生了更快、特异性更强的ataxin-2切割变体。ataxin-2是一种与神经退行性疾病相关的蛋白，BoNT/E原本无法切割它。研究团队选择其1181-1201位残基作为新切割区域（该区域与异常蛋白聚集有关）。与从天然酶出发获得的变体相比，D3进化变体切割ataxin-2的速度提高了1.4至1.7倍，同时完全检测不到对天然底物SNAP25的切割。在HEK293T细胞中，序列重新设计起点得到的变体表达更高，产生的ataxin-2切割产物更多，副产物也更少。

图｜将序列重新设计蛋白酶与野生型蛋白酶分别重新编程，使其优先切割治疗相关的非天然靶标，而非天然靶标。

尚存不足与挑战

尽管该方法前景广阔，但研究团队也坦诚指出了几项需要进一步验证的不足：

第一，目前验证主要基于BoNT/E蛋白酶。这类蛋白酶恰好适合通过序列重设计提高稳定性，且功能可在PACE中被有效选择。其他蛋白是否能享受同样的红利，仍需更多数据支撑。

第二，ataxin-2靶向蛋白酶目前仍处于工具酶和早期应用验证阶段。利用它在蛋白水平上破坏致病性ataxin-2包涵体，能否真正改善神经退行性疾病相关表型，尚待后续研究解答。

第三，安全性是不可回避的关键问题。尤其是切割非天然靶标时，除提高目标切割效率外，未来还需尽可能减少对天然底物的切割，并系统评估潜在脱靶效应、细胞毒性、递送方式及免疫安全性。

更多技术细节，详见原论文。